Pectobacterium chrysanthemi Pektin Metilesteraz Enziminin Pichia pastoris ile Rekombinant Üretimi

---

Tezin Türü: Yüksek Lisans

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2020

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: Melek ACAR

Danışman: Yağmur Ünver

Özet:

Bitkilerin hücre duvarının en önemli bileşeni olan, tüm canlı bitkilerin hücre duvarında ve hücreleri arasında bulunan pektini degrade eden pektinazlar, gıda enzimlerinin küresel satışında %25'lik bir paya sahiptirler. Bu enzimlerden biri olan pektin metilesteraz (PME) enzimi, yüksek bitkilerde yaygın olarak bulunur ve metil ester gruplarını hidroliz ederek pektini deesterifiye eder. Bu tez çalışmasında Pichia pastoris ekspresyon sistemi kullanılarak GAP (Gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz) promotörünün kontrolü altında PME enziminin ekstrasellüler üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu doğrultuda, öncelikle ekstrasellüler üretim için pGKB ekspresyon vektörüne α-faktör sinyal sekansı yerleştirilerek pGKBα vektörü elde edilmiştir. Daha sonra Pectobacterium chrysanthemi PME gen dizisi, ticari olarak temin edilen sentetik DNA'dan amplifiye edilerek pGKBα vektörüne yerleştirilmiştir. E. coli JM109 hücrelerinde klonlanarak elde edilen rekombinant vektör (pGKBα-PME), lineer hale getirilerek LiCl metodu ile P. pastoris hücrelerine transfer edilmiştir. Genomlarında PME genini taşıyan maya transformantlarının belirlenebilmesi için seçilen kolonilerden saflaştırılan genomik DNA'lar kullanılarak PCR yapılmıştır. PME genini taşıyan pozitif kolonilerin üretim besiyerinde 72 saatlik inkübasyonu ile protein üretimi gerçekleştirilmiştir. Konsantre edilen kültür sıvıları agaroz plak kuyularına yüklenerek aktivite zonu oluşumuna bakılmıştır. En büyük zon oluşumuna sahip koloniye ait kültür sıvısında SDS-PAGE analizi ile proteinin varlığı belirlenmiştir.