Anoxybacillus ayderensis Ay9 ısıl kararlı β-Glukozidazının çift mutasyonu (G226Q/Y227F), karakterizasyonu ve bazı polifenolik substratların antioksidan kapasiteleri üzerine etkilerinin araştırılması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2022
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: MİNE KARAOĞLAN
Danışman: Ahmet Adıgüzel
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Amaç: β-Glukosidazlar, birçok polifenolik bileşiği de-glikosile edebilen glikozit hidrolazlar ailesinin önemli üyeleridir. Yapılan bu tez bu çalışmasının amacı, aktif yapısındaki amino asitlerin mutasyonları ile enzimin termostabilitesini ve doğal olarak oluşan ve ticari olarak satın alınan sentetik substratlara bağlı glukoz rezidülerinin seçici olarak uzaklaştırılmasını artırmak ve sonrasında polifenolik glikozitlerin antioksidan etkilerini artırıp enzimin endüstriyel alanlarda kullanımını kolaylaştırmaktır. Yöntem: Bgl Ay9 G226Q/Y227F mutant geni PCR temelli mutagenez yöntemi ile spesifik primerler kullanılarak oluşturuldu. PCR ürünü pGEMT klonlama vektörüne aktarıldı. .DNA dizisi Anoxybacillus ayderensis Ay9'un β-glukosidaz gen dizisi ile hizalandı ve pET28(+) ekpresiyon vektörüne aktarıldı. Protein ekspresyonu için rekombinant pET28(+) vektörü taşıyan E. coli BL21 hücreleri LB içerisinde büyütüldü. Enzim ekspresyonunu indüklemek amacıyla IPTG. Rekombinant protein, Ni2+ NTA afinite kromatografisiyle saflaştırıldı ve SDS PAGE'de görüntülendi. Enzimin biyokimyasal karakterizasyon işlemleri ve doğal substratların kinetik parametleri farklı yöntemler kullanılarak oluşturuldu. Enzimin polifenolik bileşikler üzerindeki antioksidan etkisi DPPH yöntemi kullanılarak test edildi. Bulgular: PCR temelli mutagenez yöntemi ile Bgl Ay9 G226Q/Y227F geni elde edildi. Enzimin ağırlığı SDS PAGE' de yaklaşık 54 KDa olarak tespit edildi. Enzimin optimum sıcaklığı 50°C ve optimum pH 'sı 6,0 olarak belirlendi.. Enzimin pNPG substratı ile oluşturulan Km, Vmax, değerleri sırasıyla 0,246 mM, 0,057 umol/dk, olarak belirlendi. Enzimin Polidatin, Mirisetin 3-O glikozit ve Kukurbitasin 2-E-O glikozit substratları üzerinde ki antioksidan etkisi sırasıyla %54,5 , %32,95 ve %41,2 olarak saptandı. Sonuç: Yabani tip(BglA9 WT) ve mutant Bgl Ay9 G226Q/Y227F enzimin karakterizasyon sonuçları karşılaştırıldı, mutantın optimum pH seviyesinin düştüğü (pH 8'den pH 6'ya) ve çözücüler, metallerle, deterjanlar ve glukoz etkileşimlerinde değişiklikler olduğu ve Optimum sıcaklığının, yabani tip ile uyumlu olduğu tespit edildi. Bunun yanında kinetik parametreler kıyaslandığında mutant enzimin bazı substratlara karşı ilgisinin azaldığı ve çalışma kapsamında belirlenen substratlar üzerindeki antioksidan etkisi arttığı tespit edildi. Anahtar Kelimeler: β-Glukosidazlar, polifenolik bileşikler, mutasyon, DPPH