Termofilik bakterilerden lipaz üreticisi suşların belirlenmesi, enzimin saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulanabilirliğinin araştırılması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2020
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: İKRA ÖZKAN
Danışman: Ahmet Adıgüzel
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Amaç: Termofilik koşullardan sıcak su kaynaklarından temin edilen su ve çamur örneklerinde gelişim gösteren bakteri suşlarının izolasyonun yapılması; bu suşlar içerisinden yüksek derecede lipaz üretimini yapan suşun belirlenip, bu test suşunun identifikasyon ve moleküler karakterizasyonun yapılması lipaz üreten suşun belirlenip, lipaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyoteknoloji alanında uygulanabilirliği amaçlanmıştır. Yöntem: Erzurum Ilıca termal kaplıcasından alınan su ve çamur örneklerinden 11 adet termofilik bakterinin izolasyonu gerçekleştirildi. Daha sonra bu suşlardan en iyi lipolitik aktivite gösteren IO3 izolatı seçilerek, identifikasyon aşamasına geçildi. Yapılan konvensiyonel analizler sonucunda, test suşunun %2-4 tuz konsantrasyonunda, pH: 7,0-9,0'da ve 45-55°C sıcaklık değerlerinde iyi gelişebildiği, katalaz, endospor, gram, oksidaz pozitif, hareketli ve çubuk hücre morfolojisine sahip olduğu tespit edildi. 16S rRNA sekans analizi sonucunda test izolatının, %99 oranında Aeribacillus pallidus'a benzerlik gösterdiği belirlendi. Daha sonra IO3 suşundan, ekstraselüler olarak sentezlenen lipaz enzimi iki farklı strateji ile saflaştırıldı ve biyokimyasal karakterizasyonu yapıldı. Bulgular: İlk aşamada enzim, geleneksel saflaştırma metotları olan amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değişim ve jel filtrasyon kromatografisi yöntemleri ile %3,18 verimle 9,3 kat saflaştırıldı. İkinci aşamada ise, biyomoleküllerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için kullanılan yeni bir yöntem olan üçlü faz ayırma (TPP) sistemi ile %38,79 verimle, 1,54 kat saflaştırıldı. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile yaklaşık 33,88 kDa, optimum pH'sı 8,0 ve sıcaklık değeri ise, 50°C olarak belirlendi. Enzimin 20-80°C'lik sıcaklık değerleri arasında ve 120 dakikalık inkübasyon süresi sonunda, özellikle 70 ve 80°C sıcaklık değerlerinde kararlılığını sırasıyla; %69 ve %45 oranında muhafaza ettiği tespit edildi. A. pallidus IO3'ten saflaştırılan lipaz enziminin aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde; Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+ iyonları varlığında enzimin aktivitesini artırdığı gözlemlenirken; Li+ ve Cu2+ iyonları varlığında ise, enzimin kararlılık sergilediği gözlemlendi. Enzimin aktivitesini yüzey aktif maddelerin varlığında yüksek oranda artırdığı, organik çözücülerden kloroform varlığında ise, aktivitesinde %22 ve %338 oranında artış gösterdiği tespit edildi. Enzim, en yüksek aktiviteyi paranitrofenol palmitat subsratı için gösterdi. Lipaz enziminin DNTB, IAA ve EDTA ile tamamen inhibe olduğu belirlendi. β-Merkaptaetanol varlığında ise enzimin aktivitesini düşük seviyede koruduğu gözlemlendi. Bu enzim için Km ve Vmax değerleri sırasıyla 2,75 mM ve 30,77 µmol.mL-1.dk-1 olarak hesaplandı. Sonuç: Elde edilen enzimin sıvı ticari deterjanlarda aktivitesini koruduğu ve bitkisel kaynaklı lekeleri tamamen, hayvansal nitelikli yağlarla kontamine olmuş kumaş yüzeylerini ise, kısmen temizlediği gözlemlendi. Anahtar Kelimeler: Termofilik Bakteri, İzolasyon, İdentifikasyon, Lipaz, Saflaştırma, Enzim Karakterizasyonu.