AZURİN PROTEİNİNİN Pichia pastoris İLE REKOMBİNANT ÜRETİMİ
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2019
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Büşra ŞENSOY GÜN
Danışman: Yağmur Ünver
Özet:Bu çalışmada Pichia pastoris ekspresyon sisteminde sıklıkla kullanılan ve metanolle indüklenebilen AOX (alkol oksidaz) promotörünün kontrolü altında azurin proteininin üretimi gerçekleştirilmiştir. Pseudomonas aeruginosa genomik DNA'sı kullanılarak amplifiye edilen ve pPICZαA ekspresyon vektörüne yerleştirilen azurin geni, E. coli One Shot TOP10 hücrelerinde klonlanmış ve lineer hale getirilen rekombinant vektör, P. pastoris X-33 hücrelerine transfer edilmiştir. Genomlarında azurin geninin çoklu kopyasını taşıyan kolonilerin seleksiyonu için antibiyotik direnç testi ve koloni PCR reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Seçilen rekombinant transformantların protein üretim kapasiteleri karşılaştırılmıştır. Katı besiyerinde 48-72 saat inkübasyona bırakılan hücreler, gliserol içeren ön kültür besiyerlerine inoküle edilmiştir. İnkübasyon sonrası santrifüjle çöktürülen hücreler, %0,5 metanol ve %1 sorbitol içeren üretim besiyerlerine aktarılarak 48 saat boyunca çalkalamalı inkübasyona bırakılmıştır. 24 saat sonra kültür ortamlarına promotör indükleyicisi olarak %0,5 metanol ilave edilmiştir. İnkübasyon sonrası elde edilen kültür süpernatantları ve hücre lizatları ile gerçekleştirilen Western blot analizi ile transformantların tümünde rekombinant proteinin hem ekstrasellüler hem de intrasellüler üretimi gözlenmiştir. Ayrıca her iki üretim tipine göre, 1. koloniyi oluşturan hücrelerin protein üretim kapasitesinin diğer kolonileri oluşturan hücrelerin üretim kapasitesinden daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Rekombinant P. pastoris hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler azurin proteininin molekül kütlesinin yaklaşık 20 kDa olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada, P. pastoris hücrelerinde azurin proteininin ekspresyonu ilk kez gerçekleştirilmiştir.