Gıda atıklarından termofilik Bacillus licheniformiş SO7 ile üretilen alkalin proteazın manyetik alan destekli üç fazlı ayırma sistemi ile saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: GÖKSEN GÖREN
Danışman: Melda Şişecioğlu
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Amaç: Günümüzde çevresel ve ekonomik açılardan hala önemli bir sorun teşkil etmekte olan gıda atıkları, mikrobiyal süreçler sonucunda biyoteknoloji ve endüstri açısından değerli bazı ürünlerin (biyoyakıtlar, biyopolimerler, biyosürfaktanlar ve enzimler gibi) elde edilmesinde substrat olarak kullanılabilmektedir. Bu tez çalışmasında; bazı gıda atıklarından Bacillus licheniformis SO7 suşu ile üretilen alkalin proteaz enziminin Üç Fazlı Ayırma (TPP) yöntemi ve yeni bir modifikasyonu olan Manyetik Alan Destekli TPP (MFTPP) ile tek adımda hızlı ve basit olarak saflaştırılması ile birlikte biyokimyasal karakterizasyon çalışmaları yapılarak uygulanabilirliğinin gösterilmesi hedeflenmiştir. Yöntem: İlk olarak, Bacillus licheniformis SO7 (GenBank No: MG076977) suşu kullanılarak belirlenen bazı gıda atıklarından alkalin proteazın üretimi gerçekleştirildi ve en iyi üretim besiyeri seçilerek diğer çalışmalara devam edildi. Daha sonra üretilen alkalin proteazın klasik TPP ve manyetik alan destekli TPP yöntemleri ile kısmi olarak saflaştırılması gerçekleştirilerek geri kazanım üzerine etkileri karşılaştırmalı olarak incelendi. Saflaştırılan alkalin proteazın biyokimyasal karakterizasyon çalışmaları yapılarak, sığır serum albümini (BSA) hidroliz etme potansiyeli araştırıldı. Bulgular: Alkalin proteaz enzimi için en iyi sıvı üretim besiyerinin barbunya alt suyu olduğu belirlendi. Üretilen alakalin proteaz, klasik TPP ile kısmi saflaştırılması için yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda; oda sıcaklığında (25oC), pH 10, 1.0:0.5 ham enzim çözeltisi: t-bütanol oranı, %70 amonyum sülfat doygunluğunda 30 dakikada %147 verimle 3,23 kat saflaştırıldı. Daha sonra yeni bir yöntem olan MFTPP uygulamasında manyetik alan gücü, görev döngüsü ve manyetik alan süresi parametrelerinin optimizasyonu sonucunda sırasıyla 40 W'da, %30 görev döngüsüyle 6 dk'da, %181 verimle 4 kat saflaştırma gerçekleştirildi. SDS-PAGE ile enzimin molekül ağırlığı ~55,0 kDa olarak hesaplandı. Alkalin proteaz enzimi için optimum pH 7,5 ve optimum sıcaklık 40oC olarak belirlendi. Enzimin 0-90oC sıcaklık aralığında bütün değerlerde 12 saate kadar aktiviteyi %90 üzerinde koruduğu tespit edildi. %1 ve %5'lik konsantrasyonlardaki yüzey aktif maddelerin varlığında enzimin yüksek oranda stabil kaldığı, %15 ve %50'lik konsantrasyonlarda kullanılan organik çözücülerin aktiviteyi artırdığı ve 1 mM, 5mM ve 10 mM'lık metal iyonlarının varlığında enzim aktivitesinin yüksek oranda arttığı belirlendi. B. licheniformis SO7 enziminin kazein substratı için Km, Vmax, Kcat, ve Kcat/Km değerleri sırasıyla 0,240 mg/mL, 96,15 μg.mL-1.dk-1, 1,7.10-2 s-1 ve 0,071 s-1.mM-1 olarak hesaplandı. Ayrıca saflaştırılan alakalin proteazın BSA üzerinde potansiyel hidroliz etkisi test edildi ve BSA'ni yüksek oranda parçaladığı gözlemlendi. Sonuç: Biyomoleküllerin ekonomik olarak yüksek orandaki üretimi ile birlikte kısa zamanda basit şekilde saflaştırılması endüstri açısından büyük bir önem arz etmektedir. Gelişmiş ayırma tekniklerinin kullanımı ile etkili bir saflaştırma prosesi, üretimin en önemli adımlarından birisi olup toplam üretim maliyetlerinin önemli bir bölümünü oluşturmaktadır. Sonuç olarak bu tez kapsamında, manyetik alan destekli TPP'nin, alkalin proteazı klasik TPP'ye oranla yüksek verim ve saflaştırma oranı ile çok daha kısa sürede kısmi saflaştırılması için etkili ve yeni bir yöntem olduğu gösterildi. Ayrıca, B. licheniformis SO7 alkalin proteazın geniş bir sıcaklık ve pH aralığındaki aktivitesi ve kararlılığı, çeşitli metal iyonları, organik çözücüler ve yüzey aktif maddeleri varlığındaki nispeten yüksek kararlılığı ile bu enzimin endüstriyel uygulamalar için ekonomik ve uygun bir aday olduğunu göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Proteaz, Bacillus licheniformis, atık gıda, TPP, manyetik alan, BSA