Pichia pastoris'te Kendinden İndüklenebilir Bir Heterolog Protein Ekspresyon Sisteminin Geliştirilmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2021
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: BETÜL ARI
Danışman: Yağmur Ünver
Özet:Amaç: Bu çalışmada, rekombinant protein üretiminde sıklıkla kullanılan Pichia pastoris'te metanol ile indüklenebilir alkol oksidaz (AOX) promotörü kontrolünde kültür ortamına metanol ilave etmeden, kendinden indüklenebilir bir ekspresyon sisteminin geliştirilmesi amaçlandı. Yöntem: Kodon optimize yeşil floresan protein (GFP) geni, pPICZαB vektörüne klonlandı. Elde edilen pPICZαB-GFP, P. pastoris X-33 genomuna ve genomunda pGKBα-PME taşıyan P. pastoris (pGKBα-PME/X-33) genomuna entegre edildi. Ayrıca pPICZαA-Azu da pGKBα-PME/X-33 hücrelerinin genomuna entegre edildi. Elde edilen maya transformantları, YPD-zeosin agar plaklarına transfer edilerek yüksek dozda antibiyotiğe dayanıklı transformantlar seçildi. pPICZαB-GFP/X-33 hücrelerinin %0,5 metanol indüksiyonu ile GFP ekspresyonunu belirlemede floresan spektrofotometre ve SDS-PAGE analizi kullanıldı. Kendinden indüklenebilir sistemin geliştirilmesi için pGKBα-PME+pPICZαB-GFP/X-33 hücreleri, farklı konsantrasyonlarda pektin içeren besiyerinde üretime alındı. Üretim ortamındaki hücrelerde AOX protein ekspresyonunu belirlemek için western blot analizi yapıldı. Kültür ortamında metanol varlığını belirlemede GC-MS analizi kullanıldı. Farklı inkübasyon süreleri sonunda toplanan kültür sıvılarında GFP ekspresyonunu belirlemede floresan spektrofotometre ve SDS-PAGE analizi kullanıldı. Diğer yandan, pGKBα-PME+pPICZαA-Azu/X-33 hücreleri pektin içeren üretim besiyerinde inkübasyona bırakıldı. Farklı inkübasyon süreleri sonunda toplanan kültür sıvılarında azurin proteinin ekspresyonunu belirlemek için western blot analizi yapıldı. Bulgular: Metanol indüksiyonu ile pPICZαB-GFP/X-33 hücreleri tarafından en iyi ekstrasellüler GFP üretimi, 120 saatlik inkübasyon sonunda gerçekleştirildi. Farklı miktarlarda pektin içeren, metanol ilave edilmeyen kültür ortamlarında pGKBα-PME+pPICZαB-GFP/X-33 hücrelerinde AOX protein ekpresyonu gözlendi. Aynı zamanda kültür ortamlarında metanol varlığı tespit edildi. Farklı inkübasyon süreleri sonunda P. pastoris ikili promotör sistemi tarafından ekstrasellüler GFP üretiminin gerçekleştirildiği görüldü. Diğer yandan, pektin içeren üretim besiyerinde pGKBα-PME+pPICZαA-Azu/X-33 hücrelerinin azurin proteinini ürettiği gözlendi. Sonuçlar: Bu tez çalışmasında pektin içeren, metanol ilave edilmeyen ortamda rekombinant P. pastoris hücreleri tarafından hem GFP hem de azurin proteininin üretimi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Böylelikle, literatürde ilk defa Pichia pastoris'te kendinden indüklenebilir bir heterolog protein ekspresyon sistemi geliştirilmiştir. Anahtar Kelimeler: P. pastoris, Heterolog protein, İndüksiyon, Pektin, GFP, Azurin