Fe3O4@PEI10kDa ile Dekore Edilmiş Komagataella phaffii Tarafından Üretilen Candida antarctica Lipaz B Kullanılarak Biyodizel Üretimi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2025
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ŞEYDA YILDIZ ARSLAN
Danışman: Yağmur Ünver
Özet:Amaç: Bu çalışmada, indüklenebilir AOX1 promotörü (PAOX1) ve yapısal GAP promotörü (PGAP)'ın kontrolü altında rekombinant Candida antarctica lipaz B'yi ifade eden Komagataella phaffii (Pichia pastoris) hücreleri elde edildikten sonra, rekombinant hücrelerin manyetik nanopartiküllerle dekore edilmesiyle hücre dışına salınan lipaz miktarını artırmak ve elde edilen rekombinant CalB (rCalB)'nin biyokatalizör olarak kullanılmasıyla ticari ve atık kızartma (ayçiçek) yağından biyodizel üretmek amaçlandı. Yöntem: Bu çalışmada, CalB geninin kodon optimizasyonu yapıldı ve optimize geni içeren pPICZαA-CalB satın alındı. Kodon optimize CalB geni, pGKBα'ya entegre edilerek pGKBα-CalB elde edildi. K. phaffii'nin protein disülfit izomeraz geni (Pdi), pGKB'ye entegre edilerek pGKB-PDI elde edildi. K. phaffii hücrelerine, elde edilen plazmit DNA'ların sıralı bir şekilde transfer edilmesiyle farklı gen kombinasyonlarına sahip rekombinant mayalar elde edildi. Elde edilen hücreler tarafından rCalB üretildi. Enzim aktivite tayini ve SDS-PAGE analizi yapıldı. Rekombinant K. phaffii hücrelerinin manyetik nanopartiküllerle dekorasyonu için Fe3O4@PEI10kDa MNP'ler sentezlendi ve karakterizasyonu yapıldı. En yüksek lipaz üretiminin gözlendiği hücreler MNP'ler ile dekore edildi. Ticari ve atık kızartma (ayçiçek) yağı kullanılarak biyodizel üretimi için optimizasyon deneyleri gerçekleştirildi ve gaz kromatografi analizi ile yağ asidi metil esteri (FAME) içeriği belirlendi. Bulgular: Kodon optimize edildikten sonra CalB geninin kodon adaptasyon indeksi %69'dan %87'ye yükseltildi. Rekombinant plazmitler K. phaffii hücrelerine transfer edilerek pGKB-PDI/X-33, pPICZαA-CalB/X-33, pPICZαA-CalB+pGKB-PDI/X-33 ve pGKBα-CalB+pPICZαA-CalB+pGKB-PDI/X-33 hücreleri elde edildi. Enzim aktivite tayini ve SDS-PAGE analizi sonuçlarına göre yaklaşık 34 kDa'lık rCalB'nin rekombinant hücrelerde başarıyla üretilerek hücre dışına salgılandığı gözlendi. En iyi üretimin Pdi genini içeren hücrelerde olduğu gözlendi. FTIR ve TEM analizleriyle Fe3O4 nanopartiküllerinin PEI ile modifiye edildiği ve yaklaşık 14-28 nm aralığında küresel yapıya sahip olduğu belirlendi. Dekore edilen maya hücreleri (pGKBα-CalB+pPICZαA-CalB+pGKB-PDI/X-33) SEM analizi ile doğrulandı. En yüksek lipaz aktivitesi, dekore edilen hücrelerin 48 saatlik inkübasyon grubunda gözlendi. Biyodizel üretimi için optimum değerler; metanol:yağ molar oranı; 4:1, reaksiyon sıcaklığı; 30 °C, enzim içeren kültür sıvısı; 8 ml (2,4 EÜ) ve reaksiyon süresi; ticari yağda 168 saat iken atık kızartma (ayçiçek) yağında 96 saat olarak belirlendi. GC-FID analizlerine göre, üretilen biyodizelin yüksek oranda C16 ve C18 yağ asidi metil esterleri içerdiği belirlendi. Sonuç: Bu tez çalışmasında, lipaz üreten K. phaffii hücreleri elde edildi. MNP'lerle dekore edilen hücreler tarafından üretilen rCalB'nin hücre dışına daha fazla salgılandığı görüldü. Elde edilen rCalB'nin transesterifikasyonu ile üretilen biyodizelin mevcut biyodizellere alternatif olabileceği görüldü.