Termofilik Bacillus licheniformis SO5'den α-amilazın manyetik alan destekli üçlü faz ayırma sistemi ile saflaştırılması ve karakterizasyonu
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ŞEYMA ARAS
Danışman: Melda Şişecioğlu
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Amaç: Günümüzde nişasta hidrolizi mikrobiyal α-amilazlar kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Amilazlar etanol, ekmek ve yüksek fruktozlu mısır şurubu üretimi, gıda, tekstil, kağıt ve deterjan endüstrileri gibi çok çeşitli endüstriyel uygulamalarda kullanılmaktadırlar. Yapılan tez çalışmasında; Bacillus licheniformis SO5 suşundan elde edilen amilazın hızlı, tek adımlı, basit ve yeni bir teknik olan manyetik alan destekli üçlü faz ayırma sistemi (MFTPP:Magnetic Field-assisted Three Phase Partitioning) ile kısmi saflaştırılması, karakterizasyon çalışmalarının yapılması ve gıda endüstrisinde kullanım potansiyelinin araştırılması hedeflenmiştir. Yöntem: Bacillus licheniformis SO5 (GenBank No: MG076975) suşundan α-amilaz üçlü faz ayırma (TPP) kullanılarak tek bir adımda kısmi olarak saflaştırıldı. Daha sonra bu sistemin faz ayrıştırma oranlarını artırmak (yöntemin süresini azaltmak) için kullanılan teknik, manyetik alan ile kombine edildi ve manyetik alanın ekstraksiyon geri kazanımı üzerindeki etkisi incelendi. Saflaştırılan amilazın biyokimyasal karakterizasyonu yapılarak enzim preparasyonunun ekmek yapım sürecindeki performansı araştırıldı. Bulgular: α-Amilaz enziminin TPP tekniğiyle saflaştırılması sırasında ilk olarak tuz, organik çözgen, pH, süre, sıcaklık optimizasyonu yapıldı. pH 9,0'da, 1,0:1,5 (kültür sıvısı:t-bütanol oranı), %30 amonyum sülfat doygunluğunda, 60 dakika boyunca 30oC'de gerçekleştirilen TPP sonucunda enzim %105 verimle 1,84 kat saflaştırıldı. Bu tez kapsamında literatürde ilk defa uygulanan MFTPP ile manyetik alan süresi, görev döngüsü ve manyetik alan gücü değiştirilerek yapılan bir dizi deney sonucunda sırasıyla 10 dk, %30 ve 70 W'da %195 verimle 3,07 kat saflaştırma gerçekleştirildi. Enzimin molekül ağırlığı SDS-PAGE ile ~68,7 kDa olarak hesaplandı. α-Amilaz enzimi için optimum pH 7,0 ve optimum sıcaklık 50oC olarak belirlendi. Enzimin 20-90oC sıcaklık aralığında bütün değerlerde 30 ve 60. dk'da aktiviteyi %40 üzerinde koruduğu tespit edildi. %1 ve %5'lik konsantrasyonlardaki yüzey aktif maddelerin varlığında enzimin yüksek oranda stabil kaldığı, %10 ve %30'luk konsantrasyonlarda kullanılan organik çözücülerin aktiviteyi artırdığı, Fe2, Mn2, Zn2 ve Mg2 metallerinin varlığında enzim aktivitesinin arttığı belirlendi. B. licheniformis SO5 enziminin buğday nişastası substratı için Km, Vmax, Kcat, ve Kcat/Km değerleri sırasıyla 1,19 μM, 3,42 μmol.mL-1.dk-1, 1,425 s-1 ve 1,2 s-1.mM-1 olarak hesaplandı. Ayrıca fırıncılık endüstrisinde kullanım potansiyelini araştırmak amacıyla saflaştırılan α-amilaz enzimi ile pişirme testleri gerçekleştirildi ve kullanılan enzimin mayalanma, ekmek şekli ve yumuşaklık açısından ekmek yapımı üzerinde katkı sağladığı tespit edildi. Sonuç: Günümüzde biyomolekülleri saflaştırmak için gelişmiş ayırma tekniklerine yönelik güçlü bir talep bulunmaktadır. Çünkü etkili bir saflaştırma prosesi, üretimin en önemli adımlarından birisidir ve toplam maliyetin önemli bir bölümünü oluşturmaktadır. Sonuç olarak bu tez kapsamında, manyetik alan destekli TPP'nin, α-amilazın yüksek verimle kısa sürede kısmen saflaştırılması için etkili ve yeni bir teknik olduğu bulundu. Ayrıca, B. licheniformis SO5 α-amilazının geniş bir sıcaklık ve pH aralığındaki aktivitesi ve kararlılığı, çeşitli metal iyonları, organik çözücüler ve yüzey aktif maddeleri varlığındaki nispeten yüksek kararlılığı ve ekmek yapımında kullanılabilme potansiyeli bu enzimin gıda başta olmak üzere pekçok endüstriyel uygulama için uygun bir aday olduğunu göstermektedir.