Afinite kromatografisi tekniği ile tatlı turp (Raphanus sativus), Japon turpʼu (R. sativus L. var. longipinnatus) ve karnabahardan (Brassica oleracea) peroksidaz (POD) enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

NASTARAN SADEGHIAN

Afinite kromatografisi tekniği ile tatlı turp (Raphanus sativus), Japon turpʼu (R. sativus L. var. longipinnatus) ve karnabahardan (Brassica oleracea) peroksidaz (POD) enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2016

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: NASTARAN SADEGHIAN

Danışman: Hasan Özdemir

Özet:

Bu çalışmada; Tatlı Turp (Raphanus Sativus), Japon Turpu (R.sativus L. var. longipinnatus) ve Karnabahar (Brassica oleracea) bitkilerinden peroksidaz (POD) enzimi Sepharose-4B-L-tirozin-4-aminobenzohidrazit afinite kromatografisi kullanılarak tek basamakta sırasıyla %19,65 verimle 25,75 kat, %9,6 verimle 34,74 kat ve %9,75 verimle 21,23 kat saflaştırıldı. Enzim aktivitesi spektrofotometrik olarak 470 nm'de ölçüldü. Enzimlerin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlelerini belirlemek için SDS-poliakrilamid jelelektroforezi yapıldı ve tek bant gözlendi. Molekül kütleleri tatlı turp (Raphanus Sativus) POD için yaklaşık 62,25 kDa, japon turpu (R.sativus L. var. longipinnatus) POD için yaklaşık 62,21 kDa ve karnabahar (Brassica oleracea) POD için yaklaşık 57,3 kDa olarak bulundu. Enzimler üzerinde yapılan kinetik çalışmalar neticesinde optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, stabil pH sırasıyla tatlı turp (Raphanus Sativus) için 6,5, 1,0 M, 35°C, 6,5, japon turpu (R.sativus L. var. longipinnatus) için 6,5, 0,1 M, 35°C, 5,5 ve karnabahar (Brassica oleracea) için 6,00,1 M, 30°C, 5,5 olarak tespit edildi. Guaiakol substratı için saf enzimlerin Km ve Vmax değerleri hesaplandı ve tatlı turp (Raphanus Sativus) için Km 0,41 mM, Vmax 1,43 EÜ/mL, japon turp (R.sativus L. var. longipinnatus) için Km 0,56 mM, Vmax 1,50 EÜ/mL ve karnabahar (Brassica oleracea) için Km 0,64 mM, Vmax 1,95 EÜ/mL olarak belirlendi. Ayrıca saf peroksidaz enzimleri üzerine 4-aminobenzohidrazit inhibitörünün inhibisyon etkisi in vitro şartlarda ayrı ayrı incelendi. 4-aminobenzohidrazit inhibitörü her üç bitki peroksidazı içinde yarışmalı inhibisyon göstermekte olup, tatlı turp (Raphanus Sativus) ve japon turpu (R.sativus L. var. longipinnatus) ve karnabahar (Brassica oleracea) için sırasıyla IC50 değeri 0,165, 0,283 ve 0,163 mM olarak, Ki değerleri ise sırasıyla 0,1406±0,037, 0,1288±0,028 ve 0,4233±0,022 mM olarak tespit edildi.