Asetilkolinesteraz enziminin insan eritrositlerinden afinite kromatografisi ile saflaştırılması
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2012
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HABİBE BUDAK KAYA
Danışman: Hasan Özdemir
Özet:Asetilkolinesteraz (AChE) (E.C.3.1.1.7) beyinin gri cevherinde, sinir hücrelerinde, kasta, akciğer, dalak ve eritrositlerde bulunur. Aynı zamanda sarkoplazmik retikulum, lökosit, trombosit, kemik iliği ve plasentada da mevcuttur. Asetilkolinesteraz kolinerjik sinapsiste nörotransmitter asetilkolini hidroliz eder ve birçok fiziksel olayın düzenlenmesinde önemli rol oynar.Bu çalışmada, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B matriksine tirozin uzantı kolu olarak takıldı. Enzimin inhibitörü olan 9-aminoakridine molekülü tirozine kenetlendirilerek yeni bir afinite jeli hazırlandı ve bu jelden asetilkolinesteraz enzimi insan eritrositlerinden saflaştırıldı. Kan numunelerinde plazma ve lökosit tabakaları santrifüjlenerek ayrıldı. Tüplerin altında kalan eritrosit peleti %0,9 (izotonik) NaCl çözeltisi ile üç defa yıkandı. Her defasında 2500xg'de 15 dakika santrifüj edildi. Elde edilen eritrositler hacimlerinin 3 katı kadar buzlu hemoliz çözeltisi ile hemoliz edildi ve +4 ºC'de 13.000xg'de 60 dakika santrifüj yapıldı. Çökelek kısmı (membranlar) alınarak 5mL 0,1 M (pH: 7,4) Na-fosfat tamponu içinde süspanse edildi ve %1'lik Triton X-100 ile çözündürüldü. Santrifügasyondan sonra (4oC de, 13.000xg'de 60 dk) üst kısımdaki süpernatant alındı. Hazırlanan 5 mL hemolizat afinite kolonuna verildi. Saflaştırma basamakları sonucunda 0,0153 mg AChE, %23,5 verimle 658 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve tek bant bulundu (80 kDa). Enzim aktivite ölçümünde pH:7,4'de asetiltiyokolin iyodat substratı kullanıldı. Saflaştırılan AChE 'ın 20oC'de pH:7,4'de KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,372 mM ve 0,065 EÜ/mL.dk olarak belirlendi. Hazırlanan afinite kolonunda bağlanma kapasitesi 2oC'de pH:7,4 ve 0,1 M iyonik şiddet konsantrasyonunda 0,07 mg/g jel ve ligand olarak kullanılan takrin inhibitörü I50 değeri 4,5.10-5mM olarak belirlendi.Anahtar Kelimeler: Afinite, Asetilkolinesteraz, Kinetik, İnhibisyon