Benzohidrazid türevleri kullanılarak horseradısh peroksidaz (HRP) enziminin tek basamakta saflaştırılması

ZÜLEYHA ALMAZ

Benzohidrazid türevleri kullanılarak horseradısh peroksidaz (HRP) enziminin tek basamakta saflaştırılması

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2016

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: ZÜLEYHA ALMAZ

Danışman: Hasan Özdemir

Özet:

Bu çalışmada Horseradish Peroksidaz (HRP) enziminin inhibitörleri olan 4-Amino benzohidrazid ve türevi moleküller kullanılarak bu enziminin tek basamakta saflaştırması hedeflendi. Literatürde bulunan Horseradish Peroksidaz (HRP) enziminin saflaştırma çalışmalarına katkı sağlamak amacıyla ilk defa 4-Amino benzohidrazid ve türevleri olan 4-Amino 2-bromo benzohidrazid, 4-Amino 3-kloro benzohidrazid, 4-Amino 2-kloro benzohidrazid moleküller ligand olarak kullanılıp, bu enziminin saflaştırılması çalışmasına uygulandı. Kullandığımız 4-Amino benzohidrazid türevi moleküllerin metilbenzoat formlarından hidrazin sentezleri yapılarak Horseradish Peroksidaz (HRP) enzimi üzerine inhibisyon etkileri incelendi ve dönüşümlü inhibisyon gösteren moleküller Sepharose-4B-L-Tirozin jel materyaline bağlanarak elde edilen afinite jelleri ile tek kademede Horseradish Peroksidaz (HRP) enziminin saflaştırılması gerçekleştirildi. 4-Amino benzohidrazid molekülü kullanıldığında Horseradish POD enzimi, %1,8 verimle 45,4 kat, 4-Amino 2-kloro benzohidrazid molekülü kullanıldığında Horseradish POD enzimi, %4,46 verimle 149 kat, 4-Amino 3-kloro benzohidrazid ile %4,7 verimle 102,3 kat, 4-Amino 2-bromo benzohidrazid ile %3,2 verimle 129 kat, saflaştırma yapıldı. Bu kolonlardan saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı ve saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi. Horseradish Peroksidaz (HRP) enzimi için 44 kDa'da tek bant gözlendi. Tüm kolonların saflaştırma sonuçları karşılaştırıldı ve en iyi kolon olan Sepharose-4B-L-Tirozin-4-Amino-2-kloro benzohidrazid kolonu için kolon tutma kapasitesi, Horseradish Peroksidaz (HRP)enzimi için değişik pH, sıcaklık, iyonik şiddetlerde çalışıldı. Bu sonuçlara göre, 4-Amino 2-kloro benzohidrazid için 20°C'de pH 9,0'da 0,35 M iyonik şiddet konsantrasyonunda optimum bağlanma 2,99 mg/g jel olarak tespit edildi. Guaiakol substratı için KM ve Vmax değerlerinin bulunmasına yönelik yapılan çalışma sonuçlarında Horseradish (Armoracia rusticana) POD enzimi için KM değeri 4,34 mM ve Vmax değeri 0,97 EÜ/mL.dk olarak tespit edildi.