L-glutaminaz üreticisi bakterilerin topraktan taranması, izolasyonu, identifikasyonu ve L-teaninin enzimatik üretiminin geliştirilmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji Ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2024
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ESRA AYGÜN
Danışman: Melda Şişecioğlu
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Amaç: L-theanine (teanin), çaydaki umami tadını sağlayan ve birçok farmakolojik etkiye sahip olan bir aminoasittir. Enzimatik sentez yöntemi, L-teanin üretiminde yüksek verim, yüksek saflık ve düşük enerji tüketimi gibi avantajlar sunar ve endüstriyel üretim için uygundur. Ancak, L-teanin biyosentezi için gerekli enzimlerin mikrobiyal kaynakları sınırlıdır, bu yüzden daha fazla mikrobiyal kaynağın taranması ve enzimatik özelliklerinin incelenmesi gerekmektedir. Bu tez çalışmasında amaç, yüksek verimli L-teanin üretimi için literatürde belirtilen bakteri türleri dışında yeni bir bakteriyel tür veya suş taranması, bu izolatlardan L-glutaminaz enzimi üretimi ve bu enzim kullanılarak yüksek verimli L-teanin üretiminin sağlanmasıdır. Yöntem: İlk olarak, Türkiyenin farklı bölgelerinden temin edilen topraklardan L-glutaminaz ve L-teanin üretim potansiyeline sahip bakteri izolasyonu gerçekleştirildi. İzole edilen suşlar kullanılarak L-glutaminaz enzimi üretildi. Enzim aktivitesini artırmak amacıyla, enzim üretim ortam koşulları istatistiksel optimizasyon programı (Plackett-Burman) kullanılarak optimize edildi. Daha sonra seçilen bakteri ve uygun besiyerinde üretilen L-glutaminaz kültür üst sıvısı kullanılarak L-teaninin enzimatik sentezi gerçekleştirildi. Son olarak L-teaninin biyotransformasyon veriminin artırılması amacıyla üretim koşulları, Yanıt Yüzeyi Metodolojisi (RSM) kullanılarak optimize edildi ve sonuçlar LC-MC analiziyle kantitatif olarak belirlendi. Bulgular: Temin edilen toprak numunelerinden toplamda 132 adet bakteri izole edildi. Bu izolatlar bir dizi taramaya tabi tutuldu ve sonrasında en yüksek aktivitede L-glutaminaz ve en yüksek konsantrasyonda L-teanin üreten bakteriler seçilerek bu sayı 4'e düşürüldü. Daha sonra yapılan konvensiyonel ve moleküler analizler sonucunda seçilen bu 4 izolat (E-5: Lysinibacillus parviboronicapiens (Genbank No:PP819541), E-11: Aeromonas media (Genbank No:PP819513), E-12: Bacillus arachidis (Genbank No:PP819540), ve E-9: Pseudomonas iridis (Genbank No:PP828586), ) tür düzeyinde tanılandı. Yapılan taramalar sonucunda en yüksek verimde üretimi sağlayan E-9 kodlu bakteri seçilerek çalışmaya bu suşla devam edildi. Enzim üretim verimini arttırmak amacıyla besi yeri optimizasyonu yapıldı. Plackett-Burman tasarımında elde edilen verilere göre glutaminaz aktivitesi en iyi ortam şartları (İnkübasyon süresi: 40 saat, pH 7,0, sıcaklık 30°C, C kayanağı glukoz ( 2 g/L), N kaynağı amonyum sülfat (1 g/L), çalkalama hızı 130 rpm/dak) belirlendi. Belirlenen en iyi koşullarda üretilen enzim kullanılarak L-teaninin enzimatik sentezi gerçekleştirildi ve üretim parametreleri optimize edilerek (1:5 molar oran L-glutamin(donör):etilamin(aseptör, pH 11, sıcaklık 40 ºC, enzim miktarı 3mL) LC-MC analiziyle %76,204 verimle (0,025g/L) L-teanin üretimi sağlandığı kaydedildi. Sonuç: Bu tez kapsamında; mikrobiyal L-glutaminaz enzim üretimi ve L-teanin biyosentezi için en uygun bakteriyal suş araştırılmış ve daha önce literatürde bu amaçla kullanılmamış olan Pseudomonas iridis E-9 suşu izole edilerek L-glutaminaz ve L-teanin üretimi sağlanmıştır. Üretilen L-teaninin mikrobiyal kayanağının yeni olması ve üretim miktarının yüksek olması çalışmada geliştirilmiş olan bu ürünün patentlenme potansiyeli olduğunu göstermektedir.