HORSERADİSH PEROKSİDAZ ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI İÇİN YENİ BİR AFİNİTE KOMOTOGRAFİ YÖNTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2022
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SERPİL GERNİ
Danışman: Hasan Özdemir
Özet:Amaç: Bu tez çalışmasında 4-Amino benzohidroksamik asit türev molekülleri kullanılarak Horseradish Peroksidaz (HRP) enziminin tek basamakta ve yüksek verimde saflaştırılması için en etkili ve yeni afinite ligantlarının belirlenmesi hedeflendi. Yöntem: İlk defa 4-Amino 2-metoksi benzohidroksamik asit, 4-Amino 3-nitro benzohidroksamik asit, 4-Amino 3-metil benzohidroksamik asit ve 4-Amino 3-kloro benzohidroksamik asit molekülleri sentezlenerek HRP enziminin saflaştırılmasında kullanıldı. Moleküllerin metilbenzoat formlarından hidroksamik sentezleri yapılarak HRP enzimleri üzerine inhibisyon etkileri incelendi ve dönüşümlü inhibisyon gösteren moleküller Sepharose-4B-L-Tirozin jel materyaline bağlanarak elde edilen afinite jelleri ile tek kademede HRP enziminin saflaştırılması gerçekleştirildi. FT-IR ile afinite jeli kontrol edildi. Bulgular: 4-Amino 2-metoksi benzohidroksamik asit molekülü ligand olarak kullanılarak sentezlenen afinite jeli ile Horseradish POD enzimi %35,97 verimle 601,13 kat, 4-Amino 3-nitro benzohidroksamik asit molekülü %14,00 verimle 404,11 kat, 4-Amino 3-metil benzohidroksamik asit molekülü %8,70 verimle 394,88 kat, 4-Amino 3-kloro benzohidroksamik asit molekülü %4,48 verimle 284,85 kat saflaştırıldı. Tüm kolonlardan saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı ve enzim saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildikten sonra sonucun doğruluğunu teyit etmek amacıyla western blot analizi yapıldı. HRP enzimi için 40-50 kDa'da tek bant gözlendi. 4-Amino 3-nitro benzohidroksamik asit ve 4-Amino 3-metil benzohidroksamik kolonları için kolon tutma kapasitesi, HRP enzimi için değişik pH, sıcaklık, iyonik şiddetlerde çalışıldı. 4-Amino 3-nitro benzohidroksamik asit kolonu için HRP enzimi pH 8,0 sıcaklık 15°C, I 0,4 M, 4-Amino 3-metil benzohidroksamik asit kolonu için ise pH 7,5 sıcaklık 20 °C, I 0,4 M olarak hesaplandı. Sonuç: Tez kapsamında Sepharose-4B-L-tirozin-4-amino-2-metoksi benzohidroksamik asit ligandının, bilinen diğer ligandlara oranla HRP enzimini daha yüksek verimle saflaştırdığı bulundu. Anahtar Kelimeler: horseradish peroksidaz (HRP), afinite kromatografisi, saflaştırma, 4-amino benzohidroksamik asit türevleri