Pazı Kökü (Beta vulgaris L. var. cicla) Peroksidaz Enziminin Saflaştırılması, Karakterizasyonu ve Substrat Spesifikliğinin Belirlenmesi.

---

Tezin Türü: Yüksek Lisans

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2021

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: BETÜL BOLDAZ

Danışman: Hasan Özdemir

Özet:

Bu çalışmada, 4-Amino-3floro benzohidrazid ligandı sentezlenerek afinite jelinin hazırlanması ve pazı bitkisinden peroksidaz enziminin tek kademede saflaştırılması, saflaştırılacak peroksidaz enzimi için kinetik çalışmalar ve substrat spesifikliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 4-Amino-3floro benzoat molekülü ticari olarak temin edildi ve bu molekülden 4-Amino-3-floro benzohidrazid sentezi yapıldı. Sentezlen molekül Sepharose-4B-L tirozine kenetlendirildi ve pazı peroksidaz enzimi tek basamakta saflaştırıldı. Saflaştırılan POD enzimi üzerine KM, Vmax, Ki, optimum pH, optimum sıcaklık ve inhibisyon etkileri incelendi. 4-Amino-3-floro benzohidrazid molekülü ligand olarak kullanılarak sentezlenen afinite jeli ile pazı POD enzimi %8,83 verimle 50,3 kat saflaştırıldı. Saflaştırma sonucunda elde edilen enzim için sodyum dodesil sülfat–poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) yapıldı ve yaklaşık 37 kDa'da tek bant gözlendi. Saflaştırılan enzim üzerine kinetik çalışmalar guaiakol substratı varlığında yapılarak kullanılan ligandın dönüşümlü inhibisyon gösterdiği belirlendi ve IC50 değeri 577 µM ve Ki değeri 523,11±145,11 µM bulundu. Enzimin substrat spesikliği çalışmaları kapsamında 5 farklı substrat kullanılarak her bir substrat için sırasıyla, hidrojen peroksit için KM 0,05 mM, Vmax 5,91 EU/mL, ABTS için KM 0,074 mM, Vmax 37,04 EU/mL, pirokatekol için KM 1,295 mM, Vmax 58,82 EU/mL, o-Dianisidin için KM 1,724 mM, Vmax 55,55 EU/mL, guaiakol için KM 15,15 mM, Vmax 20,66 EU/mL değerleri hesaplandı. Guaiakol substratı ile yapılan çalışma sonucunda optimum pH ve optimum sıcaklık değerleri sırasıyla 5,5 ve 30 °C olarak bulundu. Yapılan çalışmada pazı peroksidaz enzimi, sentezlenen 4-Amino-3-floro benzohidrazid ligandı ile yüksek verim ve saflıkta elde edildi. Optimum pH 5,5 olarak hesaplanan ve substrat spesifite çalışmalarından en iyi substratının Lineweaver – Burk grafikleri kullanılarak guaiakol olduğu bulunmuştur.