İnsan beyin asetilkolinesteraz enziminin klonlanması, E. coli'de ekspresyonu ve enzimin karakterizasyonu

---

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2016

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: HAMİD CEYLAN

Danışman: Orhan Erdoğan

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Asetilkolinesteraz (AChE), sahip olduğu çoklu fonksiyonlarından ve özellikle kolinerjik sistemde üstlenmiş olduğu önemli rolünden dolayı dikkat çekmektedir. Bu çalışmada, insan beyin AChE cDNA'sı pET SUMO vektörüne klonlandıktan sonra protein üretimi gerçekleştirildi. Oluşturulan rekombinant konstrakt çapraz PCR ile doğrulandı. Elde edilen rekombinant klon Escherichia coli BL21 (DE-3)'de ifade ettirildi. İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranozit (IPTG) indüksiyonu ile üretilen hekzahistidin (6xHis) kuyruğuna sahip füzyon proteini nikel (Ni2+) afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Anti-His antikorları kullanılarak yapılan western blot sonucunda yaklaşık 90 kDa'luk füzyon proteini tespit edildi. Ellman metodu ile yapılan aktivite deneylerinde optimum sonuç pH 9 Glisin-NaOH tamponunda, oda sıcaklığında elde edildi. Kinetik parametre, KM ve Vmax, değerleri sırası ile 0.63 ve 0.69 olarak bulundu.