İnsan Paraoksonaz 1 (pon1) geninin klonlanması, Pichia pastoris'te ekspresyonu, Rekombinant enzimin saflaştırılması ve karakterizasyonu

---

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2014

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: YAĞMUR ÜNVER

Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Orhan Erdoğan

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Bu çalışmada metanolle indüklenen AOX (alkol oksidaz) promotörünün kontrolü altında Pichia pastoris ekspresyon sistemi kullanılarak insan paraoksonaz1(PON1) enziminin ekstrasellüler üretimi hedeflenmiş, böylece mikroorganizmanın üreme ortamına salgıladığı protein, hücreyi parçalamaya gerek kalmadan ortamdan saflaştırılabilmiştir. Bu amaçla insan PON1 geni pPICZαA ekspresyon vektörüne klonlanmış, elde edilen rekombinant vektör P. pastoris X-33 genomuna entegre edilmiştir. Böylelikle ekstrasellüler PON1 enzimi güçlü AOX promotörünün kontrolü altında eksprese edilmiş, Saccharomyces cerevisiae alfa faktör sinyal sekansı aracılığıyla enzimin fermentasyon ortamına salgılanması sağlanmıştır. Katı besiyerinde 48-72 saat geliştirilen rekombinant hücreler, gliserol içeren ön kültür besiyerine inoküle edilmiş, gelişen hücreler santrifüjle ayrıldıktan sonra metanol içeren çalkalamalı erlenmayer üretim besiyerine transfer edilerek 96 saat geliştirilmiştir. PON1 üretimi için karbon kaynağı olarak sorbitol ve AOX promotörünün indükleyicisi olarak her 24 saatte bir metanol ilave edilmiştir. SDS-PAGE ve western blot analizi, rekombinant P. pastoris tarafından üretilen ekstrasellüler PON1 enziminin molekül kütlesinin 59,1 kDa olduğunu göstermiş, ProbondTM afinite kolonu ile saflaştırıldıktan sonra enzimin biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. Bu çalışmada PON1 enzimi, ilk kez P. pastoris ekspresyon sisteminde eksprese edilmiştir.