Manyetofeksiyon Yöntemiyle Transfer Edilen Azurinin MCF-10A Hücrelerinde Heterolog Ekspresyonu
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2021
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SAADET KALAKENGER
Danışman: Yağmur Ünver
Özet:Amaç: Bu çalışmada, sağlıklı meme epitel hücrelerine (MCF-10A) Fe3O4 manyetik nanopartiküller aracılığıyla rekombinant pCMV-Azu-GFP'nin manyetofeksiyonu gerçekleştirilerek hücrelerde füzyon Azu-GFP proteininin ekspresyonu amaçlandı. Yöntem: Kodon optimize azurin geni pCMV-GFP'ye yerleştirilerek rekombinant pCMV-Azu-GFP elde edildi. Daha sonra gen aktarım aracı olarak kullanılan MNP'ler sentezlendi ve biyouyumlu hale getirmek için silika kaplama yapıldı (MSNP). Sentezlenen MSNP'lerin yüzeyi, negatif yüklü DNA'yı bağlayabilmesi için pozitif yük sağlayan PEI (MSNP@PEI) veya APTES (MSNP-NH2) ile modifiye edildi. Sentezlenen MSNP'leri karakterize etmek için TEM, FTIR ve DLS analizi kullanıldı. pCMV-Azu-GFP ve sentezlenen pozitif yüklü MSNP'ler bir araya getirilerek (manyetofektin) optimizasyon çalışmaları yapıldı. Gen aktarım aracı olarak önerilen yapının ve ayrı ayrı her bir bileşeninin proliferatif, canlılık ve sitotoksik etkisini değerlendirmek için MCF-10A hücre hattı ile MTS testi uygulandı. Sentezlenen MSNP'lerin hücresel alımı, bir floresan işaret olan Oregon-green 488 ile etiketli MSNP'ler üretilerek belirlendi. Optimum şartlarda hazırlanan manyetofektinler, mıknatıs aracılığıyla hücrelere transfer edildi. Azu-GFP füzyon proteininin MCF-10A hücrelerinde ekspresyonunu belirlemek için hücreler konfokal mikroskopta görüntülendi. Diğer yandan, hazırlanan hücre lizatlarında protein tespiti için western blot analizi yapıldı. Bulgular: pCMV-Azu-GFP, nükleotid blastlama sonucuna göre %100 doğrulukla elde edildi. Gen aktarım aracı olarak sentezlenen manyetitlerin ortalama 10 nm boyutunda olduğu, yüzey modifikasyonu yapılan MSNP'lerin ise ortalama 100 nm boyutunda olduğu, TEM ile belirlendi. DLS analiziyle yüzey modifikasyonu sonucu MSNP'lerin pozitif yüke sahip olduğu belirlendi. Manyetofektin optimizasyonu sonuçlarına göre 30 dakika inkübasyon süresinde en çok DNA bağlandığı, manyetofektin ortamı olarak PBS kullanılabileceği belirlendi. Aynı zamanda artan MSNP konsantrasyonuyla birlikte bağlanan DNA miktarının arttığı, ekstra kullanılan PEI miktarı da arttıkça bağlanan DNA miktarının arttığı belirlendi. MSNP'lerin MCF-10A hücreleri için sitotoksik olmadığı görülürken, yüzeyi modifiye edilen MSNP@PEI ve MSNP-NH2 uygulanan gruplarda doz bağımlı olarak hücre canlılığında istatistiki fark gözlendi. Hücresel alım sonuçları, 30 dakika mıknatıs tutulan gruplarda MSNP'lerin hücre çekirdeği etrafında daha iyi lokalize olduğunu ortaya koydu. Manyetofeksiyon sonucu hücrelerin konfokal mikroskop görüntülerine bakıldığında, hücrelerde füzyon proteinin ekspresyonu gözlendi. Western blot analizi sonucunda ise füzyon proteine ait azurin bandı görüldü. Sonuç: Bu tez çalışmasında MCF-10A hücrelerine manyetofeksiyon yöntemiyle başarılı bir şekilde gen aktarımı yapılarak hücrelerde Azu-GFP füzyon proteininin ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Ayrıca tümör terapisinde kullanılabilen azurinin sağlıklı hücrelerde toksik etki göstermeden ifade edildiği gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Gen klonlama, azurin, manyetofeksiyon, MCF-10A, füzyon protein