Laktoperoksidaz enziminin sığır sütünden afinite kromatografisi tekniği ile saflaştırılması

---

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2010

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: ALİ ATASEVER

Danışman: Hasan Özdemir

Özet:

Laktoperoksidaz (LPO) (E.C.1.11.1.7) memelilerin sütünde, gözyaşında ve tükürüğünde bulunan prostetik grup olarak hem grubu içeren bir glikoproteindir. Bu çalışmada sığır laktoperoksidaz (LPO) enzimi literatürde bilinen mevcut yöntemler haricinde, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B matriksi üzerine uzantı kolu olarak tirozin takılarak ve ligand olarak enzimin inhibitörleri sülfanilamid ve sülfapiridin kullanılarak sentezlenen kolon materyallerinde enzimin afinite kromatografisi tekniği ile saflaştırılması yapıldı. 200 ml yağı alınmış sığır sütü amberlite CG 50 H+ reçinesine tatbik edildi ve elde edilen homojenatın 50 ml'si hazırlanan afinite kolonuna verildi. Saflaştırma basamakları sonucunda sülfanilamid bağlı kolonla 200 ml sütten 0,77 mg LPO, %62,3 verimle 409 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve tek bant bulundu (80 kDa). Enzim aktivite ölçümünde pH:6'da 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonik asit) (ABTS) kromojenik substratı kullanıldı. Saflaştırılan LPO'nun 20oC'de pH:6'da KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,14 mM ve 0,55 ?mol/min. ml olarak belirlendi. Hazırlanan afinite kolonunda bağlanma kapasitesi 4oC'de pH:8,6 ve 0,25 M iyonik şiddet konsantrasyonunda 395 mg/g jel olarak belirlendi. Ligand olarak kullanılan sülfanilamid ve sülfapiridin inhibitörleri yarışmalı inhibisyon göstermekte olup, I50 değeri sırasıyla 8,48.10-4 ve 2,27.10-4 M olarak, Ki değerleri ise sırasıyla 3,57.10-5 M ve 6,50.10-5 olarak tespit edildi.