Sülfanilamid türevleri kullanılarak memeli sütlerinden laktoperoksidaz enziminin saflaştırılması

ZEYNEP KÖKSAL

Sülfanilamid türevleri kullanılarak memeli sütlerinden laktoperoksidaz enziminin saflaştırılması

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2015

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: ZEYNEP KÖKSAL

Danışman: Hasan Özdemir

Özet:

Laktoperoksidaz (LPO E.C.1.11.1.7) enziminin farklı memeli sütlerinden saflaştırılmasında sülfanilamid türevi olan 5-amino-2-metilbenzensülfonamid, 2-amino-5-metil-1,3-benzendisülfonamid, 3,5-diklorosülfanilamid, sulfisomidin, sulfadiazin, sulfamerazin, sulfametazin, sulfisokzol, sulfasetamid, sulfametoksipiridazin ve sulfaguanidin moleküllerinin kullanılabilirliliği araştırılmıştır. Bu amaçla önceden saflaştırılan sığır LPO enzimi kullanılarak moleküllerin kinetik parametreleri belirlenmiştir. Enzimin aktivitesini yarıya düşüren inhibitör konsantrasyonu (IC50) değeri herbir molekül için sırasıyla 0,693, 115,00, 346,50, 173,00, 92,24, 309,00, 346,50, 221,70, 3,44, 173,20 ve 17,15 µM olarak hesaplanırken Ki değerleri ise sırasıyla 0,0004, 16,37, 103,32, 122,00, 90,66, 78,00, 198,00, 182,66, 870,00, 56,30 ve 1,24 µM olarak tespit edildi. Dönüşümlü inhibisyon gösteren bu moleküllerin her biri için afinite jeli sentezlenerek sığır, koyun, manda ve keçi sütü LPO enzimi için saflaştırma tabloları hazırlandı. Saflaştırma basamakları sonucunda moleküller arasında kullanılma potansiyeli en yüksek olan 5-amino-2-metilbenzensülfonamid molekülü ile sığır sütünden LPO enzimi tek basamakta %82,68 verimle, 1059,37 kat, manda sütünden %34,67 verimle, 509,09 kat, koyun sütünden %14,35 verimle, 232,55 kat ve keçi sütünden ise %11,30 verimle, 161,90 kat saflıkta elde edilmiştir. Enzimlerin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve yaklaşık 80 kDa'lık tek bant bulundu. 5-amino-2-metil benzensülfonamid kolonundan saflaştırılan sığır LPO için optimum pH 6,0; optimum sıcaklık 45°C; Km değeri 0,15 mM ve Vmax değeri 0,6 EÜ/mL.dk iken koyun sütü LPO için optimum pH 5,5; optimum sıcaklık 60°C; Km değeri 0,08 mM ve Vmax değeri 0,05 EÜ/mL.dk olarak, manda sütü LPO için optimum pH 5,5; optimum sıcaklık 70°C; Km değeri 0,08 mM ve Vmax değeri 0,46 EÜ/mL.dk olarak, keçi LPO için optimum pH 5,5; optimum sıcaklık 70°C; Km değeri 1,42 mM ve Vmax değeri 0,07 EÜ/mL.dk olarak tespit edildi. 5-amino-2-metil benzensülfonamid kolunu için LPO'nun bağlanma kapasitesi 15°C'de, pH: 9,0'da, 0,3 M'lık iyonik şiddet konsantrasyonunda optimum bağlanma 0,05 mg/g jel olarak tespit edildi.